肝細(xì)胞離心機(jī)兩步原位灌流法分離肝細(xì)胞
目的：離體培養(yǎng)肝細(xì)胞是一種可以精確模仿體內(nèi)肝臟活動(dòng)的簡(jiǎn)單系統(tǒng)，廣泛應(yīng)用于肝病機(jī)理、藥物代謝、生物人工肝系統(tǒng)、生物化學(xué)致癌研究等。
背景知識(shí)：肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)的成功與否，主要與肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)相關(guān)。肝細(xì)胞的分離方法分為機(jī)械法和酶消化法，機(jī)械法分離的肝細(xì)胞數(shù)目很少難以滿(mǎn)足試驗(yàn)的要求。酶消化法包括胰酶消化和膠原酶消化，胰酶消化法條件難以控制因此沒(méi)有的到廣泛的推廣，膠原酶消化法早在20世紀(jì)60年代初就得到了應(yīng)用，1976年Seglen在前人的基礎(chǔ)上形成了兩步原位灌流法，這是目前國(guó)際上流行的肝細(xì)胞分離方法，它具有分離效果好，細(xì)胞產(chǎn)率高，存活率高，對(duì)細(xì)胞損傷小，細(xì)胞維持肝細(xì)胞特異性功能時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)。
原理：無(wú)
主體內(nèi)容：
參照文獻(xiàn)及本人的試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)操作步驟如下
器材：剪刀、鑷子、止血鉗、頭皮針、20ML
20ml注射器，縫合線(xiàn)、大頭針、75％乙醇、肝臟灌洗液（DHanks)、0.02%膠原酶V(加與膠原酶等質(zhì)量的Cacl2)
步驟：1、將小鼠拉頸處死，用大頭針固定于手術(shù)臺(tái)。
2、75％乙醇對(duì)腹部進(jìn)行消毒，打開(kāi)腹腔，用大頭針將腹部的皮膚固定于身體兩側(cè)，充分暴露腹腔。
3、找到門(mén)靜脈，將頭皮針插入門(mén)靜脈，用手術(shù)線(xiàn)固定頭皮針。吸取10ml肝臟灌流液從門(mén)靜脈注入肝臟，可觀察到肝臟變白膨脹，剪斷下腔靜脈時(shí)肝臟沖洗后的液體從下腔靜脈流出。
4、肝臟沖洗干凈后，注入5ml膠原酶V，室溫原位消化肝臟10分鐘。
5、將肝組織剪成小塊至于5ml 0.02％的膠原酶V中，37度消化30分鐘。
6、用膠頭滴管反復(fù)吹打擠壓肝組織使肝細(xì)胞分離脫落。
7、將細(xì)胞懸液吸至滅菌的玻璃離心管內(nèi)，加5ml DMEM完全培養(yǎng)液終止消化，800rpm離心5分鐘，可見(jiàn)白色的肝細(xì)胞沉淀。
8、吸取上清，滴一滴于載玻片上，鏡下觀察可見(jiàn)全是組織碎片而無(wú)肝細(xì)胞。
9、將上清棄掉，加加5ml DMEM完全培養(yǎng)液懸浮肝細(xì)胞，800rpm離心5分鐘。如此反復(fù)清洗肝細(xì)胞去除組織碎片。
10、將純化后的肝細(xì)胞加入10ml DMEM全培養(yǎng)液，至于10cm板37度培養(yǎng)。
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