免疫沉淀沒有它無法實現(xiàn)
今天要來講講離心機在免疫沉淀方面得重要性。
據(jù)了解染色質(zhì)免疫沉淀簡稱ChIP用來研究DNA上的特定蛋白質(zhì)。
而RNA免疫沉淀法(RIP)和ChIP相近，但RNA免疫沉淀法是用來研究會與RNA結合的蛋白質(zhì)（RNA Binding ProteinImmunoprecipitation，RNA結合蛋白免疫沉淀），是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結合情況的技術，利用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，通過離心機分離純化，對結合在復合物上的RNA 進行RT-PCR驗證或測序分析，了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡動態(tài)過程，是研究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。
RIP這種新興的技術運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術的類似應用，但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物，RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗不太相同（如復合物不需要固定，RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實驗驗證等等）。
RIP技術下游結合microarray技術被稱為RIP-Chip，幫助我們更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化，結合的RNA序列通過microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量測序（RIP-Seq）方法來鑒定。
免疫沉淀是利用抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法?？贵w與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合后，再與蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復合物，沉淀經(jīng)過洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，通過離心機離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。
免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。
免疫共沉淀實驗大致流程為:收集蛋白樣品—誘餌蛋白抗體沉淀誘餌蛋白—SDS-PAGE 分離蛋白—WB 檢測是否存在靶蛋白。
操作步驟
1.一般起步使用2個10cm2皿，用預冷的PBS洗滌細胞三次，最后一次吸干PBS；
2.加入細胞裂解液（western及IP裂解液）裂解細胞，使蛋白終濃度在1-7mg/ml；
3.4°離心10min，去除細胞碎片；注意這里需要用到冷凍離心機，因為溫度上有嚴格要求。
4.根據(jù)樣品量加入0.5-2ug左右抗體，4℃，旋轉(zhuǎn)過夜。
5.取10-30ul protein A/G 的beads于EP管中，棄上清，使用PBS洗滌beads一次。
6.將樣品加入EP管，4度垂直混勻2-3h。（在吸取瓊脂糖珠的時候，注意要搖勻管子，讓珠子和溶液混合均勻，同時黃槍頭要減掉頭子再吸取，以免破壞珠子），PBS洗脫；4度離心，棄上清，
7.洗脫三次，酌情用PBS/PBST/高鹽溶液洗瓊脂糖珠，最后一次吸干洗滌液。
8.將適量相應抗體的多肽或0.1M PH2.8的甘氨酸稀釋到細胞裂解液中，混勻，取適量于beads中進行洗脫,去除輕重鏈。若用甘氨酸HCL，樣品需要用NaOH中和，根據(jù)C1V1=C2V2計算加入NaOH的含量。
9.通過離心機離心取上清，制樣，跑膠。
以上就是關于離心機在免疫沉淀方面得講解，現(xiàn)在您知道“免疫沉淀沒有它無法實現(xiàn)”中得"它"說的是什么了吧！
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