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離心機(jī)分離生物T淋巴細(xì)胞的技術(shù)

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(一)原理 混合單個(gè)核細(xì)胞懸液在通過尼龍毛柱時(shí),B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上,而多數(shù)T細(xì)胞則通過尼龍毛柱,是獲得富含T細(xì)胞群的有效方法。

(二)材料及試劑

1.尼龍毛(Femwall Laboratories,LP-1 Leukoqak leukocyte Filters)。
2.燒杯、鋁箔、漏斗、一次性手套等。
3.裝填尼龍毛柱,一次性注射器。
4.取自然沉降的上層血漿,過聚蔗糖—泛影葡胺分層液后,獲取的血漿和分層液之間的單個(gè)核細(xì)胞層。

(三)操作方法

1.尼龍毛的清洗與干燥

(1)戴上已經(jīng)洗去滑石粉的一次性手套,將尼龍毛(1包或2包,每包35g)放入燒杯中,加入蒸餾水或去離子水,用鋁箔蓋上燒杯并煮沸約10min。
(2)冷卻至常溫,倒入漏斗內(nèi),使水滴干。
(3)重復(fù)(1)、(2)步驟6次。
(4)將尼龍毛攤在鋪有紗布的方盤內(nèi),37℃溫箱干燥2~3天后,貯藏在帶蓋的方盤內(nèi)。

2.裝尼龍毛柱

(1)取50ml玻璃注射器,拔去注射芯,在注射器頭上套一段帶夾子的膠管。
(2)將尼龍毛梳理,并適當(dāng)折疊,以適應(yīng)注射器的直徑,填入注射器內(nèi),約20ml的體積。
(3)將填好尼龍毛的注射器連同注射器芯一起包好,高壓滅菌。

3.細(xì)胞分離

(1)將注射器固定在支架上,倒入37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液,關(guān)閉閥門一定時(shí)間,然后打開閥門,放掉細(xì)胞培養(yǎng)液,以清洗幾次尼龍毛,關(guān)上閥門。
(2)將要分離的細(xì)胞液用預(yù)先加溫的培養(yǎng)液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛龋s5.00×107個(gè)細(xì)胞/ml。
(3)將細(xì)胞液倒入注射器內(nèi),使之沒過尼龍毛柱。蓋上注射器,37℃溫育45min 至1h。
(4)打開下口,緩慢放流(1滴/min),收集于離心管中。 (5)離心,即獲所需的T淋巴細(xì)胞。
(6)關(guān)閉注射器下口,于注射器內(nèi)加入0.85%冰冷生理鹽水,振蕩,并套上注射器芯,打開下口,使勁推出注射器內(nèi)液體,即獲得粘附于尼龍毛上的B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。

(四)注意事項(xiàng)

1.此種分離法,T淋巴細(xì)胞也常有一部分被吸附,吸附的多少與尼龍毛的質(zhì)量有關(guān),與裝柱的松緊也有關(guān)系。
2.此法的T淋巴細(xì)胞的回收率約20%~30%。
3.用過的尼龍毛可回收,以鹽水洗滌,然后浸入0.1Mol/L的HCl中過夜,然后再同前法清洗。 單核細(xì)胞分離技術(shù)

(一)鐵粉吸附法

1.材料及試劑

(1)鐵粉或羰基鐵粉(Atomergic chemetals)99%的純度,顆粒小于60µm(Goodfellow Metals)。
(2)強(qiáng)磁鐵(馬蹄形)。
(3)一塊小棒狀磁鐵(約1cm長)。
(4)毛細(xì)吸管等。

2.操作方法

(1)稱取一定量的鐵粉,一般為10g,用100ml生理鹽水洗滌4次,去除任何可溶性有毒物質(zhì)。在倒去鹽水時(shí),用強(qiáng)磁鐵吸住鐵粉。
(2)用50ml生理鹽水混懸鐵粉。搖勻后,分裝于10個(gè)瓶中,包扎瓶口,121℃滅菌20min,拿出后立即輕輕搖勻,防止鐵粉結(jié)塊,儲藏備用。
(3)臨用前,倒去瓶中的生理鹽水,加入適量的單個(gè)核細(xì)胞懸液(3ml~5ml,細(xì)胞總數(shù)為8×107個(gè)/瓶)。37℃溫育45min,中間不時(shí)晃動(dòng),使鐵粉懸浮起來。
(4)加入一塊小磁鐵棒于瓶中,讓其吸住鐵粉以及附著在鐵粉上的細(xì)胞。
(5)倒出懸液,此懸液主要是淋巴細(xì)胞,離心,收集。
(6)在鐵粉瓶內(nèi)倒入一定量的Hank’s液,用力振搖后,以強(qiáng)磁鐵吸附,幾分鐘后,倒出液體。
(7)2 000r/min離心液體,管底即為單核細(xì)胞。

(二)玻璃板吸附法 將分離的單個(gè)核細(xì)胞傾于無菌潔凈的玻璃平皿內(nèi),置37℃ 30 min~40min,用毛細(xì)吸管輕輕吸取懸液,即為淋巴細(xì)胞。用適量的Hank’s液沖洗平皿,收獲即為單核細(xì)胞懸液。

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